利用SW檢測(cè)篩選文庫中的β?M和CIITA低表達(dá)的克隆（分別抑制HLA-1和HLA-2）（圖1左）。使用RePlex™模塊通過NIR熒光通道在第二輪檢測(cè)總蛋白（圖1右）。類似方法用于篩選KAR配體表達(dá)（圖2）。

圖 1 Simple Western 篩選 iPSCs 中的 HLA 敲除。RePlex™ 模塊用于在探針 1（左）中同時(shí)檢測(cè) β2M 和 CIITA，在探針 2（右）中通過 NIR 檢測(cè)總蛋白。

圖3 顯示的是以野生型為對(duì)照，量化各克隆的敲低百分比，并將流式與Simple Western 進(jìn)行對(duì)比。

圖 3  通過流式及Simple Western敲低靶蛋白的數(shù)據(jù)對(duì)比。數(shù)值表示相對(duì)于野生型對(duì)照的百分比表達(dá)量（野生型表達(dá)量為100%，敲低為0%）。靶點(diǎn)CIITA和BAT3未在流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)中展示， 可能是由于它們的細(xì)胞內(nèi)定位導(dǎo)致流式檢測(cè)結(jié)果不可靠。CIITA和BAT3的敲低百分比量化數(shù)據(jù)改在表4中呈現(xiàn)。

Simple Western顯示多數(shù)克隆的靶點(diǎn)敲低率高于流式（圖3，表2）。克隆#7對(duì)5個(gè)靶點(diǎn)的敲低具有良好效果（除BAT3為69%外，其余均低于野生型50%）。

表 2 Knockdown of intracellular targets that were unreliably detected by flow cytometry were measured by the Simple Western platform. 數(shù)值表示相對(duì)于野生型對(duì)照的百分比表達(dá)量（野生型表達(dá)量設(shè)為100%，敲低為0%）

03. 殘留Cas9篩選

CRISPR-Cas9工程化iPSCs需監(jiān)測(cè)殘留Cas9，Simple Western檢測(cè)顯示所有克隆的Cas9均低于6.4 ng/mL重組對(duì)照（圖4）

經(jīng)基因改造成為通用低免疫原性供體的iPSCs需在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行功能驗(yàn)證。在此環(huán)節(jié)中，Simple Western技術(shù)相比于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)分析方法，在以下幾個(gè)方面展現(xiàn)出它的優(yōu)勢(shì)：

(1) Simple Western儀器可無差別檢測(cè)全細(xì)胞裂解液、表面蛋白及純化蛋白，全程僅需3小時(shí)且無需人工操作。

(2) 傳統(tǒng)Western blot方法可輕松轉(zhuǎn)移至Simple Western平臺(tái)。作為毛細(xì)管電泳免疫分析，其提供尺寸特異性及抗體靶向檢測(cè)，已驗(yàn)證抗體超5,000種。

(3) Simple Western檢測(cè)僅需 3 μL 微量樣本, 無需延長細(xì)胞培養(yǎng)。

(4) Simple Western具有高重復(fù)性、高靈敏度及定量分析功能。作為開放式毛細(xì)管Western blot技術(shù)平臺(tái)，Simple Western用戶可自由選用任何商業(yè)化或定制抗體，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白及其異構(gòu)體的特異性檢測(cè)。

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* 本文轉(zhuǎn)載自「ProteinSimple」微信公眾號(hào)